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荧光素酶表达系统应用原理

编辑:广州博鹭腾仪器仪表时间:2018-09-21

转录因子是一种领有特殊机关、行使调控基因表达功能的蛋白量分子,也称为反式感召因子。某些转录因子仅与其靶启动子中的特异依次连络,那些特异性的序列被称为顺式感召元件,转录因子的DNA连络域和顺式感召元件实现共价连络,从而敷衍基因的表达起抑制或增强的感召。荧光素酶报告基因实验(luciferaseAssay)是检测那类转录因子和其靶启动子中的特异依次连络的告急才智。 

其事理简述以高: 

(1)构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因量粒,如pGL3-basic等。 

(2) 将要检测的转录因子表达量粒与报告基因量粒共转染293细胞或另中干系的细胞系。若是此转录因子能够激活靶启

动子,则荧光素酶基因便会表达,荧光素酶的表达量与转录因子的感召强度成正比。 

(3) 加入特定的荧光素酶底物,荧光素酶与底物反响反应,孕育发作荧光素,通过检测荧光的强度能够测定荧光素酶的活性,从而揣摸转录因子是没有是能与此靶启动子片段有感召。 

技术流程 

(1) 用生物信息学方法说明并预测启动子区大要的转录因子连络位点。 

(2)筹划引物用PCR法从基因组DNA中克隆所需的靶启动子片段,将此片段插入到荧光素酶实验报告基因量粒(pGL3-basic)

中。 

(3)挑拣阳性克隆,测序。扩增克隆并提纯量粒备用。 

(4) 扩增转录因子量粒,提纯备用。同时豫备相应的空载量粒敷衍照,提纯备用。

(5) 哺育莳植提升293(或另中宗旨细胞),并接种于24孔板中,生长10-24小时(80%会集度)。 (6) 将报告基因量粒与转录因子表达量粒共转染细胞。 (7)提与蛋白并用于荧光素酶检测。 (8) 加入底物,测定荧光素酶的活性。 (9) 打定相对于于付荧光强度,并与空载敷衍照敷衍比。 3、生长 

双荧光素酶报告基因测试∶ 连络萤火虫和海洋腔肠荧光素酶后代的共报告基因测试技术在用萤火虫荧光素酶定量基因

表达时, 往常采用第二个报告基因往减少实验的改变因素。但传统的共报告基因(比如CAT,β-Gal, GUS)没有敷方便,因为各自的测试化学,处理哀求检测特点存在差异。Promega提供一种后代的双报告基因技术,连络了萤火虫荧光素酶测试和海洋腔肠荧光素酶测试。双荧光素酶报告基因测试系统,连络pRL 载体系统,表达第二个报告基因海洋腔肠荧光素酶,在双管中制止双荧光素酶报告基因测试,快速,灵敏,简练。系统还提供 PLB裂解液,用往裂解在多孔板中哺育莳植提升的哺乳细胞,没有需行使双个样品。敷衍于正在使用萤火虫荧光素酶报告基因载体的研究人员。双荧光素酶报告基因测试系统将使他们领会到该系统的方便。 

荧光酶基因是从萤火虫中的基因中克隆出来的,那种酶在一定前普及能够发出荧光。荧光素酶报告基因领有许多甜头,

如它没有放射性没有会敷衍实验者有危急,它比别的报告基因的报告速度更快,更灵敏等等。因而是生物学敷衍比少用的报告检测系统。


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