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产品简介

腔肠素H是几种合成腔肠素类似物之一，它们赋予水母发光蛋白复合物不同的 Ca²⁺ 亲和力和光谱特性，腔肠素H是荧光素酶（如海肾荧光素酶Rluc）的作用底物，也是水母发光蛋白的辅因子，其发光强度比天然腔肠素高10倍以上，广泛用于活体成像和报告基因检测；检测细胞/组织内活性氧（ROS）水平（腔肠素能在酶非依赖性的氧化体系中自发荧光，细胞和组织内的超氧阴离子和过氧化亚硝基阴离子能够增强该自发光信号，从而检测活性氧水平）；生物发光共振能量转移（BRET）研究，用于分析蛋白质相互作用。

另外，腔肠素H本身是水母发光蛋白（Aequorin）的发光底物。腔肠素H是水母发光蛋白复合物的组成部分，当三个钙离子与复合物结合时，腔肠素被氧化为腔肠酰胺，同时释放二氧化碳和蓝光发射峰值。因此可作为钙离子荧光探针检测活细胞中钙离子浓度，相比于常规荧光探针Fluo-4等，具有低背景、高信噪比优势，尤其需要进行长期监测（数小时到数天），或者实验体系本身自发荧光较强，腔肠素H生物发光检测是理想选择。或是应用于基于水母发光蛋白的G蛋白偶联受体（GPCR）筛选，利用腔肠素H作为发光底物，当GPCR被激活后，细胞内钙离子浓度升高，钙离子与水母发光蛋白-腔肠素复合物结合引发氧化反应发出蓝光，通过检测光信号来反映受体活性。

产品参数

 保存条件

  冰袋(wetice)运输：避光干燥保存。粉末：-20℃保存，2年有效：-80℃保存，4年有效。

 使用说明

1.制备储备液：用无水乙醇或甲醇溶解本产品，配制浓度不超过50 mg/mL的腔肠素H储备溶液，建议储备液浓度为：20 mg/mL；如：称取1 mg的腔肠素H粉末直接溶于50 μL的 无水乙醇或甲醇中，混匀后立即使用或低温保存。

2.制备稀释液：

稀释液体系1配方为：5% DMSO+30% PEG300+5% Tween 80+60% ddH2O；

稀释液体系2配方为：丙二醇和柠檬酸溶液（5%~10%）以8:2 或 9:1混合（体积比）；稀释液体系3配方为：无水乙醇和生理盐水以1：3混合（体积比）；

根据实验条件，也可选用不含Ca2+/Mg2+的PBS缓冲液、生理盐水或者其他类型生理缓冲液（pH6.6 - 7.2）来稀释，但本产品在这些缓冲液的溶解浓度上限是0.4 mg/mL。

3.荧光素酶检测实验：在细胞表达的荧光素酶检测体系中，推荐的工作浓度为0.004mg/mL，具体用量需根据实验优化，体外实验在加样完成后即可进行发光检测或拍照。

4.体内实验：在动物活体实验中，推荐按1 mg/kg体重的腔肠素H用量进行注射。如：用生理盐水将腔肠素H储备液稀释至0.2 mg/mL，20 g重的小鼠通过腹腔注射100 μL工作液后进行活体成像。

体内实验推荐拍摄时间：腹腔注射10-20 min、尾静脉注射2-5 min。

注：上述工作浓度及检测时间只做推荐参考；本产品用于动物活体成像分析、体外生物发光检测的最佳工作浓度、检测时间请自行参考相关文献，或根据实验目的、所培养的特定细胞和组织等，进行预实验摸索和优化。

5.活细胞钙离子检测实验：

①细胞准备：首先需要构建检测体系，通过转染等方式，让细胞稳定表达水母发光蛋白的基因（通常是脱辅基水母发光蛋白Aequorin）。若使用外源蛋白，需要进行微注射等方式导入待检测细胞。构建好的工程细胞以一定密度接种到多孔板中。

②孵育细胞和腔肠素H：将1-10 μM浓度范围的腔肠素H与细胞共同孵育1-2小时，腔肠素H具有细胞膜渗透性，可以进入细胞内部，与已表达的水母发光蛋白结合，形成完整、有功能的水母发光蛋白复合物。

注：腔肠素H水溶性极低，避免添加甲醇的潜在细胞毒性作用，含50 mM 2-羟丙基-β-环糊精的中性缓冲液可使溶解度显著增大，腔肠素H孵育具体浓度和孵育时间需根据细胞种类，参考文献等条件进行优化。

③检测钙信号：当细胞受到刺激，胞内钙离子浓度升高时，钙离子会与这个复合物结合，立刻触发腔肠素H发生氧化反应，产生蓝光（峰值约在466 nm）。使用化学发光检测仪检测，发光强度与钙离子浓度呈正相关，从而实现对钙离子动态的监测，腔肠素H对钙离子的动态检测范围很宽，大约在0.1 µM 至100 µM.

6.基于水母发光蛋白的GPCR筛选实验：

①构建稳定表达系统：构建能稳定表达目的GPCR、水母发光蛋白（Aequorin）及特定G蛋白（如嵌合G蛋白Gα16或突变G蛋白以将信号导向钙通路）的细胞系

②细胞准备与探针加载：将构建好的工程细胞以一定密度接种到多孔板（如96孔或384孔板）中。在检测前，向培养基中加入腔肠素H，在37°C避光孵育一段时间，让腔肠素H进入细胞与水母发光蛋白结合。可尝试1-10 μM的腔肠素H与细胞共同孵育1-2小时。注：孵育浓度和孵育时间需根据细胞种类，参考文献等条件进行优化。

③化合物处理与信号检测：使用自动化设备向各孔中加入待测化合物。立即使用化学发光检测仪（如酶标仪）测量每个孔的发光信号。

④数据处理与分析通常通过比较化合物处理组与空白对照组（仅加缓冲液）和阳性对照组（如已知受体激动剂）的发光信号强度来判断结果。

注意事项

1．为了您的自身安全，实验前请做好有效防护； 

2．腔肠素H 的干燥粉末在密封状态下较稳定，可避光保存于 -20℃ 或更低温度。可通过在管内充入惰性气体（氮气或氩气）防止其氧化。

3．该产品适用于体外生物发光检测；对于活体动物成像检测，建议参考文献的详细参数。

4．不同种类的荧光素酶存在很大的区别。如腔肠素H 和腔肠素F 可作为海肾荧光素酶的底物，但对于 Gaussia 荧光素酶是无效的。

5．本产品仅供科研使用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内！