¢ 产品规格
产品名称 | 产品编号 | 规格 | 目录价 |
Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒 | AFP001 | 100T | 1480元
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¢ 产品描述
Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒为 AnnexinV与 PI联合使用的试剂盒，用于检测细胞凋亡早期的发生，可区分凋亡早期凋亡细胞和晚期凋亡或坏死细胞。
Annexin V 为胞内蛋白膜联蛋白家族成员，以钙离子依赖的方式选择性与磷脂酰丝氨酸(PS)结合。PS正常分布在细胞膜内侧。PS 外翻到细胞膜外是不同类型的细胞在凋亡早期的明显特征，用带有 FITC 标记的 AnnexinV，即 Annexin V-FITC，可通过流式细胞仪或荧光显微镜检测到这一重要特征。FITC呈现黄绿色荧光。
Pl（Propidium lodide，碘化丙啶）是一种可对 DNA 染色的细胞核染色试剂，在嵌入DNA 后释放红色荧光。PI不能穿透完整的细胞膜，但可以穿透坏死细胞或凋亡晚期丧失细胞膜完整性的细胞。
Annexin V-FITC与 PI联合使用时，PI被排除在活细胞(Annexin V-/PI-)和早期凋亡细胞 (AnnexinV+/PI-)外，而晚期凋亡细胞和坏死细胞同时被 FITC 和 PI结合染色呈现双阳性(Annexin V+/PI+)。
FITC最大吸收波长和激发波长分别为 494nm和518nm，PI-DNA复合物的最大吸收和发射波长分别为535 nm 和 617 nm。
¢ 保存条件
4℃保存，有效期18个月；不可冷冻
¢ 产品组分
组分 | 规格 |
A. Annexin V-FITC | 500 μL |
B. Propidium iodide | 1 mL |
C. Binding Buffer(1×) | 100 mL |
¢ 使用方法
下列实验方案以利用星形孢菌素诱导 Jurkat 细胞凋亡为例，如果使用其他诱导剂和其他类型的细胞，实验条件需要略作调整。
1. 流式细胞检测
(1) 根据实验要求诱导细胞凋亡。检测样品中应包含未经处理的细胞样品，作为阴性对照。此外，建议设定一组样品做(Annexin V-FITC或PI)单染，用于调节补偿。
(2) 收集细胞。
悬浮细胞：300g，4°C离心 5min 收集细胞；
贴壁细胞：用不含 EDTA 的胰酶消化后 300g，4℃离心 5min收集细胞，胰酶消化时间不宜过长，以防引起假阳性。
注：用胰蛋白酶消化然后使细胞在最佳细胞培养条件和培养基中恢复约30min，然后再染色。胰蛋白酶消化会暂时破坏质膜，允许Annexin V-FITC结合磷脂酰丝氨酸在细胞膜的细胞质表面上，从而导致假阳性染色。
(3) 用预冷的PBS洗涤细胞两次，每次均在 300g，4℃下离心5min，收集1-5×105 个细胞并用100μL 1×结合缓冲液重悬细胞。
(4) 每管加入 4-5 μL 的 Annexin V-FITC 和5 μL 的 PI工作液。
注：推荐准备两管额外的流式管，每管只加入一种单染染料(Annexin V-FITC或PI)，用于流式单染的补偿调节。
(5) 室温避光孵育 10-15 min，为避免细胞凋亡进程，孵育过程可在冰上操作。
(6) 每管加入 400 uL 的 PBS 或 1×结合缓冲液，尽快通过流式细胞仪检测细胞凋亡情况。AnnexinV-FITC 可以由 488nm 激光激发，检测荧光发射光谱约在530nm 处（FITC 通道），PI通道发射光谱约在 617nm 处。
注：PBS 或 1×结合缓冲液的选择根据不同凋亡处理以及不同细胞具体选择。
2.荧光显微镜检测
对于悬浮细胞，可参照流式细胞检测的方法进行具体操作。
(1) 在盖玻片或载玻片小室中接种细胞。
(2) 根据实验要求诱导细胞凋亡。检测样品中应包含未经处理的细胞样品，作为阴性对照。
(3) 用 PBS 洗涤细胞。
注：细胞收集后如果不用 PBS 清洗，可以用含血清的培养基直接替代AnnexinV 结合缓冲液，但是 Annexinv 的使用浓度需要重新优化。
(4 )每 100 μL 的 AnnexinV结合缓冲液中加入 5-25 μL的 Annexin V-FITC 和5 μL 的 Pl。
注：最佳使用浓度由具体实验要求确定。
(5) 向培养板中加入足量的染液以覆盖全部细胞，室温避光孵育 15-30 min。为避免细胞凋亡进程，孵育过程可在冰上操作，但孵育时间至少延长至 30 min。
(6) 用 1×结合缓冲液清洗细胞。
(7) 将孵育有细胞的盖玻片置于载玻片上，载玻片可提前加一滴 1×结合缓冲液；对于培养在小室内的细胞可直接加入足量的 1×结合缓冲液覆盖细胞。
(8) 使用合适的滤光片在荧光显微镜下观察细胞。AnnexinV-FITC 可用 FITC 适用的滤光片，PI 可用 Cy3或者 Texas。
¢ 注意事项
1. 荧光染料均存在猝灭问题，保存和使用过程中请尽量注意避光，以减缓荧光猝灭。
2. 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
3. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。