试剂产品

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产品组分

产品简介

超氧化物检测试剂盒（DHE）用于细胞内超氧阴离子定性、定量检测。病理状态下超氧阴离子蓄积会造成氧化应激损伤。本试剂盒以二氢乙锭（DHE）为荧光探针，其可穿透细胞膜，与超氧阴离子反应生成溴化乙锭，后者结合核酸后发出红色荧光，荧光强度对应超氧阴离子含量，可借助荧光显微镜、流式细胞仪、酶标仪完成检测，适用于氧化应激研究、细胞模型评估及抗氧化药物筛选。试剂盒配备佛波酯（PMA）作为阳性对照，可刺激细胞生成超氧阴离子，用于实验质控，保障结果稳定可靠。

保存条件

DHE(1000X)和PMA(1000X)于-20 ℃保存，1年有效。其中DHE(1000X)须避光保存，尽量避免反复冻融，可适当进行分装。Assay Buffer于2–8℃（4℃最佳），避光密封保存，未开封 12–18月；开封后 2–4周内用完。

使用说明

1.配制DHE染色液

按照96孔板每孔100 μL DHE染色液的体系,配制适量DHE染色液，并充分混匀。例如：每孔中加入0.1 μL DHE(1000X)和99.9 μL Assay Buffer，充分混匀使用。

注：配制DHE染色液时注意避光，且须现配现用，稀释后不能长期保存。DHE最优先的推荐终浓度为1X，对大多数细胞都适用，但为了得到更理想的结果，对于不同类型的细胞请自行进行一定摸索，DHE的终浓度通常为0.5-2X。

2.设置阳性对照

取 1000×PMA 阳性对照，按 1:1000 比例加入细胞培养液，常规孵育 60 分钟（可依细胞类型调整），再加 DHE 染色液检测。评价药效时，可在加 PMA 前后同步加药共孵育。注：PMA终浓度通常为0.5-2X，最优先的推荐终浓度为1X，仅加入阳性组，可能对某些细胞效果较弱或者完全没有效果。

3.荧光显微镜检测

1)         将细胞接种于96孔板等多孔板、细胞培养皿中或者细胞爬片上，按实验设计对细胞进行一定处理；

2)         对于贴壁细胞，吸除培养液，用Assay Buffer洗涤细胞1次；对于悬浮细胞，250-1000×g室温离心5分钟，吸除上清，用Assay Buffer洗涤1次。

注：酚红或血清对于本试剂盒的检测有一定的干扰，吸除培养液和Assay Buffer时推荐使用真空泵。在能充分吸净残留液体的情况下，可以不使用Assay Buffer洗涤。

3)         加入适当体积的DHE染色液。通常96孔板每孔加入100 μL，24孔板每孔加入250 μL，12孔板每孔加入500 μL，6孔板每孔加入1 mL。37ºC避光孵育20分钟。孵育时间可在10-30分钟之间进行调整。

4)         孵育结束后可以直接在荧光显微镜下观察染色效果。如果发现荧光背景比较高，可以酌情洗涤1-3次后再在荧光显微镜下观察染色效果。DHE为红色荧光，Ex/Em = 535/610nm。

注：如果是首次实验不能确定孵育时间，建议先尝试37ºC孵育20分钟，观察荧光效果。如果正常细胞染色较深，则适当缩短时间；如果荧光强度太弱，则适当延长时间。

4.     流式细胞仪检测

1)         将细胞接种于6孔板或细胞培养皿中，按实验设计对细胞进行一定处理。

2)         贴壁细胞胰酶消化后用培养液重悬，并用Assay Buffer洗涤一次；悬浮细胞250-1000×g室温离心5分钟，弃上清，用Assay Buffer洗涤一次。每个样品推荐的细胞用量为100万个细胞。

3)         对于上一步骤的100万个细胞的沉淀，加入1 mL DHE染色液，重悬为单细胞悬液。37ºC避光孵育20分钟。孵育时间可在10-60分钟之间进行调整。

注：如果是首次实验不能确定孵育时间，建议先尝试37ºC孵育20分钟，观察荧光效果。如果正常细胞染色较深，则适当缩短时间；如果荧光强度太弱，则适当延长时间。孵育后可以酌情用Assay Buffer洗涤1-3次。

4)         可以直接进行流式细胞仪检测，也可以250-1000×g室温离心5分钟沉淀细胞，吸净液体后每个样品加入0.5  mL检测缓冲液重悬细胞后用流式细胞仪检测(DHE为红色荧光，Ex/Em = 535/610nm)。

注：由于流式检测比较灵敏，使用的荧光探针浓度可能要比荧光显微镜检测时要低，此时可根据细胞类型和实际染色情况对DHE稀释倍数进行适当调整。

5.     荧光酶标仪检测

1） 将细胞接种于96孔板黑色多孔板中，每孔的细胞数需要控制在100-10000个，通常宜在2000-5000个范围内。按实验设计对细胞进行一定处理。

2） 对于贴壁细胞，吸除培养液，用Assay Buffer洗涤细胞1次；对于悬浮细胞，250-1000×g室温离心5分钟，吸除上清，用Assay Buffer洗涤1次。酚红或血清对于本试剂盒的检测有一定的干扰，吸除培养液和Assay Buffer时最好使用真空泵。在能充分吸净残留液体的情况下，可以不使用Assay Buffer洗涤。

3） 加入适量的DHE染色液，通常96孔板每孔加入100 μL。37ºC避光孵育20分钟。孵育时间可在10-30分钟之间进行调整。

注：如果是首次实验不能确定孵育时间，建议先尝试37ºC孵育20分钟，观察荧光效果。如果正常细胞染色较深，则适当缩短时间；如果荧光强度太弱，则适当延长时间。孵育后可酌情用Assay Buffer洗涤1-3次。

孵育结束后，可直接用荧光酶标仪检测。如果发现荧光背景比较高，可以酌情洗涤1-3次后再用荧光酶标仪进行检测。DHE为红色荧光，Ex/Em = 535/610 nm。通过对比对照组与处理组的RFU (Relative fluorescence values)，可以得出药物刺激的效果。

注意事项

1)         DHE易在空气中氧化，请尽量避免暴露于空气中，且DHE脱氢后产生一定毒性的Ethidium，请注意防护；

2)         BSA和酚红对DHE的检测有干扰，需避免。

3)         本产品仅供科研使用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内！

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。