产品规格
产品名称 | 产品编号 | 规格 | 售价 |
ROS检测试剂盒(DCFH-DA) | ROK001 | 1000T | 580 |
ROK002 | 10T | 20 |
产品组分
组分编号 | 组分名称 | 产品编号/规格 |
ROK001/1000T | ROK002/10T |
ROK001/ROK002-A | DCFH-DA | 100 μL | 1 μL |
ROK001/ROK002-B | Rosup | 1 mL | 10 μL |
ROK001/ROK002-C | DCFH-DA Assay Buffer | 200 mL | 2 mL |
产品简介
DCFH-DA 是活细胞及组织内活性氧（ROS）检测的经典荧光探针。其本身无荧光且脂溶性良好，可自由穿透活细胞膜，入胞后被酯酶水解为无法外流的 DCFH。DCFH 同样无荧光，可被胞内 ROS 特异性氧化为强荧光的 DCF，荧光强度与胞内 ROS 水平正相关，可通过荧光显微镜、流式细胞仪等设备定性定量检测胞内 ROS 的含量与动态变化。Rosup 为 ROS 阳性诱导剂，可上调胞内 ROS 水平构建阳性对照，用于验证检测体系有效性、校准实验参数，确保结果真实可靠。
保存条件
DCFH-DA 与 Rosup 均于 - 20℃保存，有效期 1 年；其中 DCFH-DA 需避光，避免反复冻融，建议分装。DCFH-DA 检测缓冲液于 2–8℃（4℃最佳）避光密封保存，未开封有效期 12–18 个月，开封后 2–4 周内用完。
使用说明
1. 装载 ROS 探针
1.1 原位装载探针 (仅适用于贴壁细胞)
1) 细胞准备：需在检测前一天进行细胞铺板，确保检测时细胞数量小于 5×105/mL。
2) 药物诱导：去除细胞培养液，加入 DCFH-DA Assay Buffer稀释的药物处理，于 37℃细胞培养箱内避光孵育，实际诱导时间由药物特性和细胞类型决定。
3) （可选）阳性对照：先用 DCFH-DA Assay Buffer等稀释阳性对照 （Rosup, 1000X）到常用工作浓度 1X，加入细胞， 37℃避光孵育 30 min-4 h，以提高活性氧水平，不同细胞类型存在差异。例如：HeLa 细胞需孵育 30-60 min，MRC5 人胚胎成纤维细胞则需孵育 90 min。
4) ROS 探针准备：探针装载前按照 1:1000 用 DCFH-DA Assay Buffer稀释 DCFH-DA，使其终浓度为 1X。
5) ROS 探针装载：吸除处理药物，加入适当体积稀释好的 DCFH-DA 工作液。加入的体积需充分盖住细胞。例如：6 孔板通常不少于 1000 μL，对于 96 孔板通常不少于 100 μL。 37℃细胞培养箱内避光孵育 30 min。
6) 细胞清洗：用 DCFH-DA Assay Buffer洗涤细胞 1-2 次，以充分去除未进入细胞内的 DCFH-DA。
1.2 收集细胞后装载探针 (适用于贴壁细胞和悬浮细胞)
1) 细胞准备：按照标准方法培养细胞，必须保证检测用细胞状态。按照适当方法，清洗并收集足量的细胞。
2) 药物诱导：将收集好的细胞悬浮于适量稀释好的药物，于 37℃细胞培养箱内避光孵育，实际诱导时间由药物特性和细胞类型决定。
3） （可选）阳性对照：先用 DCFH-DA Assay Buffer稀释阳性对照（Rosup, 1000X）到常用工作浓度 1X，加入细胞，37℃ 避光孵育 30 min-4 h 以提高活性氧水平，不同细胞类型存在差异。例如：HeLa 细胞需孵育 30-60 min，MRC5人胚胎成纤维细胞则需孵育 90min。
4） ROS 探针准备：探针装载前，按照 1:1000 用 DCFH-DA Assay Buffer稀释 DCFH-DA，使其终浓度为 1X。
5） 探针装载：除去细胞内药物，离心收集细胞，加入稀释好的探针，使其细胞密度为 1.0×106- 2.0×107。
注：细胞密度需根据后续的检测体系，检测方法，以及检测总量来进行调整。例如：对于流式分析，单管检测内细胞数目不少于104，也不可多于 106。
6） 细胞清洗：用 DCFH-DA Assay Buffer洗涤细胞 1-2 次，以充分去除未进入细胞内的 DCFH-DA。
2.荧光显微镜检测
1) 对贴壁生长细胞或活组织，可直接在荧光显微镜下观察；对悬浮生长细胞，取 25-50 μL 细胞悬液滴到一张显微载玻片上，再盖上一张盖玻片；
2) 荧光显微镜下，选用 FITC 滤光片观察荧光，去除背景观察荧光的变化；
3.流式细胞仪检测
1) 对贴壁生长细胞，用胰酶消化制备成单细胞悬液；对悬浮生长细胞，直接收集细胞。用 0.5-1 mL PBS 重悬细胞 (0.5-1 x 105/mL)。
2) 选择流式细胞仪 FL1 或 BL1 通道，488 nm 激发，测定 530 nm 的发射，细胞应可分成两个亚群：ROS 阴性细胞仅有很低的荧光强度，ROS 阳性细胞有较强的绿色荧光。
4.酶标仪检测
1) 推荐使用黑色96孔板进行测试，确保细胞24小时落板后进行检测。孵育结束后，小心吸除孔内染色液，沿着孔壁缓慢加入适量的PBS洗涤细胞1次并更换为完全培养液，随后用荧光酶标仪检测(DCFH-DA为绿色荧光，Ex/Em=488/525nm)。通过对比对照组荧光探针的RFU (Relative fluorescence units)，可以计算出细胞内活性氧的相对比例关系。荧光酶标仪的检测，推荐作为快速检测和筛选用途。
注：任何液体吸除或加入的过程须轻缓，避免破坏细胞。
注意事项
1. 阳性对照 Rosup：常规浓度 1X（推荐 1-4X，依细胞类型调整），刺激 30min-4h 可观察到 ROS 显著升高；效果不佳时可适当调整浓度或诱导时间。
2. 阴性对照荧光过强：将 DCFH-DA 按 1:2000-1:5000 稀释（终浓度 0.2-0.5X），探针装载时间可在 15-60min 内调整。
3. Rosup 仅用于制备阳性对照样品，无需加入所有检测样品。
4. 探针装载完成后，必须彻底洗净胞外残余探针，避免背景荧光过高
5. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
6. 本产品仅供科研使用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内！