试剂产品

产品规格

产品简介

本产品是一种以PKH26（红色，Ex/Em:551 nm，567 nm）亲脂性荧光染料的膜整合标记外泌体，PKH 染料是高度亲脂性的长链羰花青荧光染料，其中脂肪族尾部可以迅速嵌入暴露的脂质双层并形成强的非共价相互作用，以用于研究外泌体的靶向、吞噬和运输机制等，可使用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、荧光酶标仪、流式细胞仪等荧光检测系统进行检测。PKH26也可用于常规细胞膜标记，用于体外细胞标记和体内细胞追踪，详情见细胞膜染料产品。

外泌体PKH26标记试剂盒（含超滤纯化管）提供染料、稀释液、标记终止液以及100 kDa的超滤纯化管，形成“标记-终止-纯化”一体化解决方案。提供专用终止液，在标记完成后立即加入，迅速结合并消耗游离染料，避免超滤操作期间染料的持续非特异性结合，保证标记真实、背景干净；超滤精准去除游离染料与BSA-染料复合物。

产品组成

保存条件

冰袋运输，-20 ℃ 避光保存，有效期12个月（PKH67母液严格避光并拧紧盖子，防止溶剂挥发），保存在Dilution C的染色工作液，需在使用前配置，且现配现用。

使用方法

需自备试剂和耗材：

（1）试剂： 1×PBS溶液，BCA蛋白浓度测试试剂盒（可做可不做）

一．外泌体准备及定量（可做可不做）：

为保证最佳的染色效果，需进行BCA蛋白浓度测定以确定外泌体蛋白量，选择合适的PKH26染色用量。

若为冻干外泌体，使用100 μL的Diluent C液或其他合适溶液（不含血清或BSA的PBS等溶液）分散；若为外泌体溶液，浓缩至合适体积，且保证体系较高的外泌体的纯度和浓度，浓度过低可能会影响标记效果。

二．PKH26染料工作液配置

1，试剂盒配备为1 mM（EtOH）的母液，使用前检查是否结晶，若有结晶，超声或涡旋直至完全溶解后离心片刻，将盖和管内壁上的液体离心至管底，避免开盖时试剂损失；取适量PKH26母液，先用Diluent C稀释10倍，配置为100μM的工作液，取适量的工作液加入外泌体溶液中，使用Diluent C液定容，使其体系标记浓度在2~20 μM，推荐尝试10 μM的终浓度。

如：10 μg外泌体染色，取2 μL母液，用18 μL的Diluent C液稀释成100μM的工作液，然后取10 μL工作液加入已经稀释好的100 μL外泌体溶液中涡旋混匀。

注：1，PKH26易水解，工作液需现配现用；2，PKH67标记终浓度需根据不同外泌体、外泌体颗粒数、纯度等实验体系通过预实验进行优化，且避免在很小(<100 μL)或很大(>5 mL)的体积下进行外泌体的标记；3，PKH67母液不可直接加入外泌体溶液中，必须经过Diluent C液稀释后加入外泌体溶液；4，Diluent C液为亲脂性膜染料标记专用液，无生理盐和缓冲剂，最大化染料溶解性，减少PKH染料的自聚集，因此标记体系尽可能在Diluent C液进行。

三．PKH26染色及终止

加入后孵育1-5分钟，然后用等体系体积的标记终止液（1% BSA）来结合多余的染料。

注：1，标记孵育时间不可过长，通常不能超过10分钟，标记时间过长可能会导致外泌体膜完整性丧失；2，以避免未标记的游离PKH26染料后续直接染色细胞，建议空白设置对照（外泌体溶液换成PBS溶液，其他操作正常）以确定终止效果。

四．去除多余染料

本试剂盒提供100KDa的超滤纯化滤管，膜含有微量的甘油及保护剂，使用前需提前过滤去离子水或缓冲液超滤进行过膜并重复多次，滤膜一旦润湿，就需要保持湿润状态。

在终止的标记反应液中，加入2倍体积的Dilution C，用移液器轻轻吹打混匀，稀释游离染料，在4℃下，将稀释后的外泌体标记混合液加入内管不超过0.5mL，以5000 ×g，离心5-10 min，然后弃外管流出液，向内管加入适量PBS，继续离心操作，重复操作几次，最后回收外泌体将内管倒置在另一个干净的离心管中离心片刻即可收集到纯化后的荧光外泌体。

其他方法也可用于纯化标记物，例如按照外泌体纯化方法（如SEC法）再次提取外泌体以去除多余染料或染色终止剂。

注：染色后的外泌体体系都需要进行纯化处理，未标记的游离PKH67染料后续将直接染色细胞，所有再次提取纯化方法会损失一部分外泌体

注意事项

1．为了您的自身安全，实验前请做好有效防护。

2．PKH26易水解，母液建议分装用封口袋于 - 20 ℃避光保存，工作液且现配现用。

3．PKH26应用广泛，还用于细胞膜的标记，详情请见PKH26红色色细胞膜染色试剂盒产品。

4．超滤管的正确使用请参见本司超滤管产品官网产品介绍或说明书。

5．本产品仅供科研使用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内!